بررسی میزان ATP در اسپرم مولدین نر ماهی كفال طلایی

توضیحات

 بررسی میزان ATP در اسپرم مولدین نر ماهی كفال طلایی دارای 107 صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد بررسی میزان ATP در اسپرم مولدین نر ماهی كفال طلایی  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

این پروژه توسط مرکز مرکز پروژه و مقالات ارائه میگردد

توجه : در صورت  مشاهده  بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی بررسی میزان ATP در اسپرم مولدین نر ماهی كفال طلایی،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد

بخشی از متن بررسی میزان ATP در اسپرم مولدین نر ماهی كفال طلایی :

بررسی میزان ATP در اسپرم مولدین نر ماهی كفال طلایی

چکیده

کفال ماهیان دریای خزر یکی از مهمترین ماهیان شیلاتی این دریا می باشند.که پس از انتقال از دریای سیاه به دریای خزر، توانستند خود را بااکوسیستم این دریا مطاقبت دهند.

هدف از این تحقیق بررسی میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی در شرایط زمانی،دمایی و محلولهای تداوم بخش (Extender) مختلف بوده است. بدین منظور میزان ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دماهای مختلف (°C12- 10،20 -18)، میزان ATPاسپرمهای نگهداری شده دردماهای مختلف (°C 4،Room temperature ) به مدت 6 ساعت، میزان ATP اسپرمهای نگهداری شده در محلولهای تداوم بخش (extender)مختلف (گلیسرول، محلول نمک 7/0% ، محلول نمک 65/0%) به مدت 5 روز، میزان ATP اسپرمهای نگهداری شده در همان شرایط به مدت 10 روز، به روش فوق حساس بیولومینوسانس اندازه گیری گردید.

براساس آزمایشات انجام شده در این تحقیق، غلظت ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دمای °C 12- 10، 22/7 ± 04/74درصد غلظت ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دمای °C20- 18 بود.اسپرمهای نگهداری شده در دمای °C 4 یخچال به مدت 6 ساعت و اسپرمهای نگهداری شده در دمای آزمایشگاه به مدت 6 ساعت به ترتیب 91/0 ± 26/90 درصد و 49/1 ± 17/17 درصد ATP خود را حفظ کردند. نگهداری اسپرم درextender های مختلف (گلیسرول، محلول نمک 7/0% ، محلول نمک 65/0%) به مدت 5 روز نشان داد که گلیسرول و محلول نمک 65/0%، درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% حفظ کردند. نگهداری اسپرم درهمان extender‌ها به مدت 10 روز نشان داد که گلیسرول درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک 7/0% و 65/0% حفظ کرد. اسپرمهای نگهداری شده در گلیسرول در دمای °C 15- بعد از 5 روز و اسپرمهای نگهداری شده در گلیسرول در دمای °C 15- بعد از 10 روز به ترتیب 5/4 ± 19/74 و 2/6 ± 67/47 درصد ATP خود را حفظ کردند. اسپرمهای نگهداری شده در محلول نمک 7/0% در دمای °C 1 بعد از 5 روز و اسپرمهای نگهداری شده در محلول نمک 7/0% در دمای °C 1 بعد از 10 روز به ترتیب 81/2 ± 65/13 و 06/0 ± 69/0 درصد ATP خود را حفظ کردند. اسپرمهای نگهداری شده در محلول نمک 65/0% در دمای °C15- بعد از 5 روز و اسپرمهای نگهداری شده درمحلول نمک 65/0% در دمای °C 15 - بعد از 10 روز به ترتیب 68/6 ± 58/73 و 12/0 ±05/1 درصد ATP خود را حفظ کردند.

براساس نتایج به دست آمده برای حفظ میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی، نمونه گیری در دمای °C20- 18 و نگهداری در گلیسرول توصیه می شود.

مقدمه

اسپرم عامل مهم تولیدمثل، بقاء و تداوم نسل است. بررسی اسپرم از نظر پارامترهایی مانند توانایی تلقیح، تحرک، درصد اسپرمهای متحرک، سرعت حرکت، فرکانس ضربه تاژکی، میزانATP و فاکتورهای شیمیایی و بیوشیمیایی، در تشخیص کیفیت اسپرم و کنترل روند تولیدمثلی برخی جانداران از جمله آبزیان کمک می کند. هدف از این تحقیق بررسی میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی در شرایط دمایی ، زمانی و محلولهای تداوم بخش مختلف می باشد. تاکنون تحقیقات گسترده ای توسط پژوهشگران مختلف روی این سلول صورت گرفته است. با این حال مطالعات انجام شده در ارتباط با میزان ATP اسپرم ماهیان نسبتأ محدود است. این امر تفسیر علت ناموفق بودن پروژه پرورشی کردن برخی ماهیان را دشوار می کند. در این رابطه باید مطالعات بیشتری در زمینه بررسی میزان ATP اسپرم ماهیان صورت پذیرد.

اسپرم به کمک حرکت ضربه ای تاژک خود شنا می کند. انرژی مورد نیاز برای این حرکت ازطریق هیدرولیز ATP فراهم می شود(Billard et al, 1999 ).تحرک اسپرم به میزان ATPذخیره ای اولیه (Christen et al, 1987) و میزان ATP سنتز شده در طول فاز تحرک (Lahnsteiner et al, 1999 ) وابسته است. در اکثر ماهیانی که دارای لقاح خارجی هستند، ATP سنتتاز قادر به نگهداری نسبتهای بالای ATP هیدرولیز شده مورد نیاز در طول حرکت نیست، لذا میزان ATPبه سرعت کاهش می‌یابد. این کاهش ATP به موازات کاهش تعداد ضربات تاژکی و سرعت حرکت اسپرم است (Christen et al, 1987 و Perchec et al, 1995). تفاوت قابل توجهی بین گونه‌ها در مقدارATP مورد نیاز برای تامین حرکت اسپرم وجود دارد(Mansour et al, 2003 ).

در این مطالعه میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی در شرایط مختلف دمایی نمونه گیری (10-12و 18-20 درجه سانتیگراد) و نگهداری 6 ساعته در دماهای مختلف ( دمای اتاق و 4 درجه سانتی گراد) در محلولهای تداوم بخش مختلف( گلیسرول، محلولهای نمکی 65/0 و 7/0 درصد) در زمانهای متفاوت ( 5 روز و 10 روز) به کمک روش فوق حساس بیولومینوسانس مورد اندازه گیری قرار خواهد گرفت.

1- 1 پیشینه تحقیق

امروزه کشورهای پیشرفته به دلیل تلاش بیشتر و برخورداری از امکانات پیشرفته تر، در زمینه ویژگیهای اسپرم ماهیان و عوامل موثر بر آن تجارب زیادی کسب نموده اند. اطلاعات بدست آمده عمدتأ در مورد ماهیان پرورشی می با شد. دراین مورد کارهای تحقیقاتی زیادی انجام شده است و مطالعات گسترده ایی در خصوص عوامل تاثیرگذار، استرس زا و یا آلوده کننده صورت گرفته نتایج حاصله با یکدیگر مقایسه شده اند. به مواردی از این پژوهشها در ذیل اشاره شده است.

ماهیان آبشش آبی نر به دو شیوه تولید مثل می کنند. برخی از نرها که parental نام دارند تولیدمثلشان تا سن 7 سالگی به تاخیر می افتد، اما گروه دیگر (sneaker) زودتر بالغ میشوند. طبق مطالعات Burness و همکارانش در سال 2004 در هر دو شیوه تولیدمثلی، سرعت حرکت اسپرم و سطوح ATP در 60 ثانیه اول تحرک اسپرم به موازات هم کاهش می یابد. اگرچه میزان ATP اولیه اسپرم ماهیان sneakerنسبت به ماهیان parental بیشتر است ولی بین شیوه های تولید مثلی آنها تفاوتی وجود ندارد. ضمنأ از لحاظ سرعت حرکت اسپرم، درصد اسپرمهای متحرک یا فعالیت آنزیمهای متابولیک بین شیوه های تولیدمثلی تفاوتی وجود ندارد. هرچند اسپرم ماهیان parental تا حدودی نسبت بالاتری از کراتین فسفوکیناز را نسبت به سیترات سنتاز دارا می باشند. در هر دو شیوه با افزایش فعالیت کراتین فسفوکیناز و سیترات سنتاز، میزان ATPاسپرم افزایش (Burness et al, 2004) می یابد.

طبق گزارشات Kruger و همکارانش در سال 1983 میانگین مدت زمان تحرک اسپرم کپورماهی معمولی Cyprinus carpio به فصل وابستگی داشته و حدودا 2/1 تا 6/1 دقیقه است Kruger et al , 1983)). ماکزیمم مدت زمان تحرک اسپرم کپورماهی معمولی 2 دقیقه است 1984) ، .( Koldras and Moczarsk در کپورماهی، اسپرم و ادرار از یک مجرای تناسلی آزاد می شوند لذا ممکن است اسپرم جمع آوری شده از آن توسط ادرار آلوده شود. طبق مطالعات Perchec و همکارانش در سال 1998 درصورت آلوده نشدن اسپرم ماهی به ادرار، میزان ATP اسپرم حدود nmol 9 – 8 به ازاء 10⁸ اسپرم و سرعت ابتدایی آن حدود s/ mm 160 - 100 و فرکانس ضربه تاژکی حدود 50 - 30 اندازه گیری شد. اما، وقتی که
مایع اسپرمی با 5/7% ادرار به مدت 1 ساعت آلوده شد، میزان ATP،nmol 5 – 4 به ازاء 10⁸ اسپرم بود و اغلب اسپرمها سرعت ابتدایی کمی معادل s/ 100 – 30 و فرکانس ضربه تاژکی حدود 30 – 10 داشتند. این مسئله نشان می دهد که اسمولالیته پایین ادرارعامل کاهش کیفیت اسپرم کپورماهی است .(Poupard et al, 1998)

Zilli و همکارانش در سال 2004 نشان دادند که یک رابطه خطی بین ظرفیت تلقیح اسپرم و پارامترهای اسپرمی از جمله میزان ATPو فعالیت آمینوترانسفراز وجود دارد Zilli et al, 2004) ). طبق گزارشات Jezierska و Witeska در سال 1999 اسپرمهای کپور معمولی مدت زمان s 80 – 70، فعال می مانند و تحرکشان بعد از 24 ساعت کاهش می یابد، در حالی که اسپرمهای کپورعلفخوار s 55 – 30 فعال می مانند و تحرکشان پس از 8 ساعت کاهش می یابد. اسپرمهای کپورمعمولی پس از 24 ساعت حدود s10 متحرک می مانند. مدت زمان تحرک اسپرم متاثر از دمایی است که در آن نگهداری می‌شود. حتی نگهداری کوتاه مدت اسپرم (15 دقیقه) در دمای 20°C، موجب کاهش مدت زمان تحرک اسپرم در هر دو گونه ماهی می شود. بطوریکه پس از 2 ساعت نگهداری اسپرم کپورماهی معمولی در دمای 20°C ، تحرک اسپرم حدود 50% کاهش می یابد ( 1999، Jezierska and Witeska).

اسپرمهای نگهداری شده در دمای صفر تا °C 5 قادر به تلقیح تخم هستند. بهرحال چگونگی نگهداری اسپرمها، روی مدت زمان تحرک اسپرم اثر می گذارد Goodal et al, 1989)). در دماهای پایین تر، مدت زمان تحرک اسپرم طولانی تر است (1996،Babiak،Glogowski). نگهداری اسپرم به مدت 5 ساعت در یخچال (°C 5) روی نسبت تلقیح اسپرم اثر قابل توجهی ندارد. اسپرم کپورماهی معمولی بدون کاهش قابل توجه زمان تحرکش ، حدود 24 ساعت و اسپرم کپور علفخوار حدود 8 ساعت می تواند در یخچال(°C 5) نگهداری شود (Sarnowski et al, 1997 ).

بحث و نتیجه گیری

تابحال تحقیقات زیادی در ارتباط با اسپرم ماهی در جهان صورت گرفته است. هر یک از مطالعات مذکور جنبه خاصی را مد نظر قرار داده اند. با این حال اطلاعات محدودی در خصوص میزان ATP اسپرم ماهی و اثر فاکتورهای محیطی، شیمیایی و بیوشیمیایی بر آن وجود دارد. در ضمن تحقیقی در رابطه با میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی تاکنون صورت نگرفته است. ماهی کفال طلایی یکی از گونه های مهم ماهیان شیلاتی است که تاکنون موفق به تکثیر و پرورش آن نشده اند. شاید بتوان از این طریق برای فراهم آوردن شرایط مناسب به منظور تکثیر و پرورش این نوع ماهی و یا در شرایط خاص به منظور نگهداری اسپرم آن استفاده کرد.

طبق گزارشات Perchec و همکارانش(1997،Perchec et al) در صورت عدم آلودگی اسپرم به ادرار، میزانATP آن حدود nmol/10⁸ 9 – 8 اسپرم و در صورت آلوده شدن به ادرار، میزانATP آن حدود nmol/10⁸ 5 – 4 اسپرم بود. در واقع اسمولالیته پایین ادرار با تحریک اولیه موجب کاهش ذخیره ATP سلولی و کاهش کیفیت اسپرم کپور می شود. لذا در این تحقیق برای ممانعت از کاهش کیفیت اسپرم، در طول نمونه گیری از آلوده شدن اسپرم به ادرار و هر گونه ماده آلوده کننده ای جلوگیری شد.

طبق گزارشات Gary و همکارانش( 2004،et al Gary)، برای اندازه گیری غلظت ATP، لوسیفرین – لوسیفراز (حل شده در mM 100 گلایسین، mM20 ₄MgSO، 4/7 pH) به نمونه ها افزوده و سیگنالهای بیولومینوسانس با استفاده از یک دستگاه لومینومترLmax،96 چاهکی(USA، CA، Devices Sunngvale، Molecular) اندازه گیری شد. میزان ATP هر نمونه با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه و بصورت 10⁸ pmol/ اسپرم بیان شدد. درگزارش Ogier و همکارانش(1999 ،Ogier et al) میزان ATP را با استفاده از روش بیولومینوسانس (اندازه گیری بیولومینوسانس ATP ، kit cls، Boehringer – Mannheim ) ، پس از استخراج با اسید تری کلرواستیک 2% ، mM2 EDTA اندازه گیری کردند و به صورت nmol/10⁸ اسپرم بیان نمودند. در گزارش Perchec و همکارانش (1998 Perchec et al.) میزان ATP توسط روش بیولومینوسانس اندازه گیری شد. آنها ابتدا اسپرم ماهی کپور معمولی را به نسبت 1:100 درمحلول بافر HEPES جوشان تجزیه کرده و سپس با افزودن لوسیفرین – لوسیفراز به اسپرم، سیگنالهای لومینوسانس را بوسیله (Biocounter M2010A Lumac/3M) اندازه گیری کردند و سپس میزان ATP را با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه و بصورت nmol/10⁸ اسپرم بیان نمودند. در این تحقیق برای اندازه گیری میزان ATP از روش بیولومینوسانس استفاده شد. ابتدا نمونه اسپرم به نسبت 1:100 درمحلول بافر HEPES جوشان مخلوط شده سپس 50 از آن با 50 از محلول کیت حساس بیولومینوسانس در پلیت مخصوص اندازه گیری لومینوسانس با هم مخلوط و سیگنالهای لومینوسانس با استفاده از دستگاه لومینومتر(Germany، mol/well 10 ^-195، BMG Labtech GmbH، Lumisatr) اندازه گیری شد. سپس میزان ATPهر نمونه با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه و بصورت nmol/10⁸ اسپرم بیان شد. نتایج حاصل از این تحقیق موارد ذیل را مشخص نمود.

بررسی میزان ATP در اسپرم مولدین نر ماهی كفال طلایی
فهرست مطالب

عنوان صفحه

چكیده-------------------------------------------------------------1

مقدمه---------------------------------------------------------------3

فصل اول : مروری بر تحقیقات گذشته

1-1 پیشینه تحقیق---------------------------------------------------- 5

1-2 تاكسونومی----------------------------------------------------- 7

1-3 مشخصات كلی راسته كفال ماهی شكلان -------------------------------- 8

1-4 مشخصات خانواده كفال ماهیان -------------------------------------- 9

1-5 مشخصات كفال طلایی -------------------------------------------- 9

1-6 زیست شناسی كفال طلایی ----------------------------------------- 10

1-6-1 مشخصات زیستی كفال طلایی------------------------------------- 11

1-6-1-1 تحمل درجه حرارت------------------------------------------ 11

1-6-1-2 تحمل شوری ---------------------------------------------- 11

1-6-1-3 تحمل مقادیر اكسیژن ----------------------------------------- 11

1-6-1-4 تغذیه كفال طلایی ------------------------------------------- 12

1-7 ارزش اقتصادی كفال ماهیان ----------------------------------------- 12

1-8 ارزش غذایی ماهی كفال ------------------------------------------- 13

1-9 پراكنش كفال ماهیان ---------------------------------------------- 14

1-10 دریای خزر---------------------------------------------------- 16

1-11 تولید مثل كفال طلایی -------------------------------------------- 18

1-11-1 دستگاه تولید مثل كفال طلایی ------------------------------------ 19

1-11-2 اسپرماتوژنز ------------------------------------------------- 21

1-11-3 ساختمان اسپرماتوزوئید ---------------------------------------- 21

1-11-4 فعالیت اسپرماتوزوئید ------------------------------------------ 22

1-11-5 رابطه بین میزان ATP و تحرك اسپرم ------------------------------ 23

1-11-6 مكانیزم چرخشی انتقال انرژی در ATP سنتاز ------------------------ 23

1-11-7 AMP حلقوی بعنوان یك پیامبر ثانویه ------------------------------ 26

1-11-8 محلولهای تداوم بخش یا extenders ----------------------------- 31

فصل دوم: روش تحقیق و مواد

2-1 مواد و وسایل مورد نیاز -------------------------------------------- 35

2-1-1 خصوصیات كیت تعیین ATP ------------------------------------ 36

2-1-2 اجزای كیت تعیین ATP ----------------------------------------- 36

2-1-3 روش آماده سازی محلولها --------------------------------------- 37

2-1-4 خصوصیات و كاربردهای بافر HEPES ----------------------------- 37

2-1-5 روش آماده سازی محلول بافر HEPES------------------------------ 38

2-1-6 روش آماده سازی محلول بی كربنات سدیم --------------------------- 38

2-1-7 روش آماده سازی محلول گلیسرول 10% و گلوكزM 3/0 ---------------- 38

2-2 روش كار ----------------------------------------------------- 38

فصل سوم : نتایج تحقیق

نتایج ------------------------------------------------------------- 44

فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری و پیشنهادات

بحث و نتیجه گیری --------------------------------------------------- 56

پیشنهادات --------------------------------------------------------- 62

پیوست------------------------------------------------------------ 63

منابع فارسی -------------------------------------------------------- 89

منابع لاتین---------------------------------------------------------- 90

چکیده انگلیسی------------------------------------------------------ 94

بررسی میزان ATP در اسپرم مولدین نر ماهی كفال طلایی
فهرست جداول

عنوان صفحه

جدول 1-1 -------------------------------------------------------- 27

جدول 3-1--------------------------------------------------------- 45

جدول 3-2--------------------------------------------------------- 45

جدول 3-3--------------------------------------------------------- 46

جدول 3-4--------------------------------------------------------- 46

جدول 3-5--------------------------------------------------------- 47

جدول 3-6--------------------------------------------------------- 47

جدول 3-7--------------------------------------------------------- 47

جدول 3-8--------------------------------------------------------- 49

جدول 3-9--------------------------------------------------------- 49

جدول 3-10------------------------------------------------------- 49

جدول 3-11------------------------------------------------------- 54

بررسی میزان ATP در اسپرم مولدین نر ماهی كفال طلایی
فهرست نمودارها

عنوان صفحه

نمودار1------------------------------------------------------------ 45

نمودار 2----------------------------------------------------------- 46

نمودار 3----------------------------------------------------------- 48

نمودار 4----------------------------------------------------------- 50

نمودار 5----------------------------------------------------------- 51

نمودار 6 ---------------------------------------------------------- 52

نمودار 7----------------------------------------------------------- 53

بررسی میزان ATP در اسپرم مولدین نر ماهی كفال طلایی
فهرست اشكال

عنوان صفحه

شكل 1-1 --------------------------------------------------------- 9

شكل 1-2---------------------------------------------------------- 10

شكل 1-3---------------------------------------------------------- 15

شكل 1-4---------------------------------------------------------- 21

شكل 1-5---------------------------------------------------------- 24

شكل 1-6---------------------------------------------------------- 29

شكل 1-7---------------------------------------------------------- 30

شكل 2-1---------------------------------------------------------- 37

شکل 2-2---------------------------------------------------------- 41

برای دریافت اینجا کلیک کنید