توضیحات

توجه : به همراه فایل word این محصول فایل پاورپوینت (PowerPoint) و اسلاید های آن به صورت هدیه ارائه خواهد شد

 تحقیق در مورد بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها دارای 20 صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد تحقیق در مورد بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

توجه : در صورت  مشاهده  بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی تحقیق در مورد بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد


بخشی از متن تحقیق در مورد بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها :

بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها

خلاصه :
کریپتوسپوریدیایی انسان ها یک بیماری روده ای است که معمولاً به علت عفونت در cryptosporidium hominis یا c-parvum به وجود می آید . این بیماری بیشتر از راه دهان – مدفوعی منتقل می شود (آب یا غذا) و اثر اجتماعی – اقتصادی عمده ای در جهان دارد .

عامل اصلی در پیشگیری ، مراقبت و کنترل کریپتوسپوریدیایی ، تشخیص و ویژگی ژنتیکی گونه های عمده و گوناگونی جمعیت ( که ژنوتیپ یا subgenotye هم خوانده می شود ) کریپتوسپوریدیای منتقل شده به انسان است به خصوص اینکه در حال حاضر هیچ شیمی درمانی موثر ضد کریپتوسپوریدیا یا واکسنی وجود ندارد . در این تحقیق ، ما با استفاده از

دومین جدا کننده رونویسی داخلی (ITS-2) DNA ریبوزومی هسته ای به عنوان نشانه ژنتیکی ، روش بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) واکنش زنجیره ی پلیمری جفت شده را برای تشخیص سرایت c-parvum, Cryptosporidium hominis یا c.meleagridis بنا کردیم . یک ارزیابی از منحنی ، تغییر پذیرهای داخلی کوچکتر از %15 و تغییر پذیری های معیاری

داخلی کوچکتر از %35 را معلوم کرد . c.parvum , Cryptosporidium hominis و c.meleagridis با استفاده از 143 نمونه DNA ی انگل های کریپتوسپوریدیم که از استرالیایی های مبتلا به کریپتوسپوریدیا گرفته شده به ترتیب در سال های 2,44,97 کشف شدند . منحنی های ذوبی که با حداکثر دمای c°33/0 ± 47/72 درجه و c°45/0 ± 19/74 درجه سانتی گراد (

نمودار1) ، c°32/0 ± 17/72 (نمودار 2) و c°03/0 ± 33/73 (نمودار3) مشخص می شوند به طور ژنتیکی به ترتیب به عنوان c.hominis c.parvum , و c.meleagridis شناخته می شوند . در نتیجه ، بررسی ذوب PCR جفت شده ی ITS-2 باعث تشخیص c.hominis c.parvum , و c.meleagridis شد . این راه مناسب ترین راه برای آزمایش سریع تعداد زیادی از نمونه های DNA ی انگلی کریپتوسپوریدیم است و اگر چه کیفی است نسبت به بررسی الکتروفورتیک به طور قابل توجهی زمان کمتری برای اجرا می گیرد و مزیت افزوده ذخیره ی اطلاعات و قابلیت آنالیز در سیلیکو را نیز دارا می باشد . این روش ابزار مناسبی برای بررسی همه گیری و شیوع کریپتوسپوریدیا را در اختیار می گذارد و قابل اجرا برای انواع دیگر کریپتوسپوریدیا به جز آن هایی که در این جا بررسی شد ، می باشد .

 

1 مقدمه :
کریپتوسپوریدیای انسانی معمولاً یک بیماری روده ای است که توسط انواع کریپتوسپوریدیا ایجاد می شود و به وسیله راه های دهانی – مدفوعی منتقل می شود [1] . این بیماری به طور ناگهانی اتفاق می افتد [2و3] اما عموماً به دوران کودکی – مراکز مراقبت مربوط می شود و از استخرهای شنا یا آب های نوشیدنی منابع سرایت می کند . [4-9] . بحث دوم که

مهم است ، این است که انگل های اولیه Cryptosporidium در مقابل مواد ضد عفونی کننده مثل کلر که عموماً برای پاکسازی آب استفاده می شود ، مقاوم هستند [10-12] . شیوع های از راه آب که از کشورهای توسعه یافته مثل آمریکا و کانادا گزارش شده اند و قابل توجه ترین آن که در سال 1993 در Milwaukee اتفاق افتاد منجر به 5000 مورد تایید شده و بیش از 400،000 مورد مشکوک به کریپتوسپوریدیا شد [4و5و13و14] . به علت حالت جهندگی انگل ها در آب و محیط [15] ، هزینه نسبتاً بالا و دسترسی محدود به ترکیبات شیمیایی یا

رژیم های درمانی یا واکسیناسیون در انسان ها و دیگر حیوانات [16-20] و اثر اجتماعی – اقتصادی آن ( مخصوصاٌ در جوامع انسانی که در آن ایدز / HIV شایع است ) . کریپتوسپوریدیا توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) به عنوان یک عامل بیماری زا که کیفیت آب را نشان می دهد ، رده بندی شد [12] . تشخیص قاطع کریپتوسپوریدیا در انسان ها که شامل شناسایی و تشریح خصوصیات انواع کریپتوسپوریدیا است ، عامل اصلی در کنترل این بیماری و فهمیدن عواقب همه گیری آن است . محدودیت های قابل توجهی با بکارگیری روش های سنتی ، میکروسکوپی ، بیوشیمیایی و سرم خونی برای تشخیص قاطع وجود داشته اند به طوری که ابزارهای ژنتیکی – مولکولی پیشرفته شناسایی و توسعه یافته اند [22] . با

استفاده از این ابزارها در حال حاضر ، بیش از 18 نوع کریپتوسپوریدیا و تعداد زیادی ژنوتیپ شناخته شده است [6و23و24] که c.hominis و c.parvum نوع غالب آن ها هستند و در انسان ها پر اهمیت ترین هستند ( به جز تعداد معدودی ، بقیه انواع هم اغلب به این دسته تعلق دارند ) ( مثل [26-28] ) . ابزارهایی که بر مبنای وواکنش زنجیره ی پلیمری (DCR) هستند به طور گسترده ای به کار گرفته شده اند ، چون حساسیت آنها گسترش خاصی از مکان ژنتیکی را از مقدار ناچیزی از مواد انگلی مجازی دارد [29] . مکان های مختلف که شامل واحد تبعی کوچکی [667] از فضاگیرهای RNA ریبوزومی هسته ای و DNA ی ریبوزومی (rDNA) ، پروتئین چسبناک مربوط به ترومبوسپونوین (trop) ، پروتئین شوک حرارتی

(hsp70) 70KDa و ژن های پروتئین دیواره انگلی کریپتوسپوریدیا (cowp) می شود ، برای شناسایی و اختلاف بین انواع کریپتوسپوریدیا و متغییرهای ژنتیکی ( ژنوتیپ و ژنوتیپ وابسته) به کار گرفته می شوند [22] . اخیراً ، PCR جفت با روش های پویش جهشی الکتروفوز ترکیب شده با زنجیره ی DNA ، برای این هدف به کار گرفته می شوند [30-31] . برای مثال ، برای غلبه بر محدودیت هایی که در آنالیز تغییر پذیری متوالی در حین فرآورده های PCR وجود داشت پولیمر فسیم ( چند ریختی بودن ) ترکیبی تک استانداردی (sscp) ، برای نمایش مستقیم

اختلاف ژنتیکی در hsp70 , SSU و دومین فضاگیر داخلی رونویسی (ITS – 2) هسته ای rDNA ی c.hominis و c.parvum معین شدند [30-36] . مزیت های این روش های الکتروفورزی (مثل خاص بودن ، حساسیت و قابلیت تکثیر کم و زیاد ) از میان نتایجی که از مقایسه مستقیم یک روش SSCP با تعدادی از روش های مختلف مولکولی که برای توصیف ویژگی های ژنتیکی یک نوع کریپتوسپوریدیای انتخاب شده بدست آمد ، اثبات شد [37] . اگرچه این روش بسیار مفید و موثر است ولی آنالیز الکتروفورزی ، در بعضی موارد ، می تواند وقت گیر باشد

.
به علت نیاز افزوده به تشخیص با بازده بالا و بررسی ژنتیکی عامل بیماری و نیز جا به جایی اطلاعات ، بررسی ذخیره سازی در سیلیکو ، توجه قابل ملاحظه ای روی ارزیابی و گسترش روش های مرور جهش وجود داشته است که به مشخصه های ذوب امپلیکن ها و آنالیز الکتروفورزی گریزی وابسته است . این روش که خصوصاً برای آنالیز منحنی ذوب با تکنیک بالا (HRM) و منحنی ذوب مبتنی بر RCR به کار می رود ( مثال [38-41] ) و به طور قابل توجهی زمان مورد نیاز برای آزمایش را کاهش می دهد ، می تواند به سرعت بالای آشکارسازی

جهش برای امپلیکن های کوچک ( معمولاً bp100 تا 250) برسد [42 تا 45] و منجر به نتایج کیفی و کمی شود . [38و46-49] . در این تحقیق ، روش کاربردی آنالیز منحنی ذوب PCR جفت شده ارزیابی و بنا شد ، ITC – 2 به عنوان ژنتیک ساز برای آشکارسازی نوع غالب کریپتوسپوریدیای سرایت شده به انسان به کار گرفته شد و در مورد دلایل این روش تشخیصی- مولکولی بحث شد .
2- مواد و روش ها

21 نمونه ها و جداسازی DNA ژنومی
نمونه های مدفوعی (143 =n) از بیماران مبتلا به کریپتوسپوریدیا از استرالیا جمع آوری شدند . تشخیص کوپرولوجیکی کریپتوسپوریدیا بر اساس آشکارسازی انگل ها با استفاده از روش لکه دار کردن اصلاح شده ذیل – نیلسن ایجاد شده [50] . DNA ژنومی همان طور که توسط مورگان و دیگران توصیف شده از نمونه های مدفوعی استخراج شد [51] . در اصل ، نمونه های مدفوعی فردی در محلول نمک بافر فسفات (PBS) معلق بودند (1:4) . سوسپانسیون ( محلول ) یکدست و یکنواخت شده و lµ20 از آن بیرون کشیده شد و به lµ80 از (pvpp) (sigma) پلی پیرولیدرن پلی دینل %10 معلق در H2O اضافه شد . بعد از اضافه شدن PVPP ، نمونه ها برای 10 دقیقه در دمای c°100 حرارت دیدند و سپس برای 30 ثانیه در kg

10،000 سانتریفیوژ شدند . بعد از سانتریفیوژ ، هر یک از ذرات شناور به یک لوله جدید منتقل شد و کل DNA با استفاده از mini-column (Qiagen,copro-kit,Germany) براساس دستورالعمل سازنده جداسازی شد . نمونه های DNA ژنومی قبلاً براساس PCR ترتیب دهی شده با SSCP لوسی با SSU یا ژن گلیکو پرتئین KDa60 (gp60) به انواع مختلف طبقه بندی شد [30 و 31] .

 

22 . توسعه آنزیمی و آنالیز منحنی ذوب :
ناحیه ی ITS-2 ( bp440 450 ، شامل توالی جانبی ) PCR ای بود که با استفاده از پریمرهای AP58SF (مستقیم : 5′-ATC TCT CAA GCG AAA TAG CAG TAA-3′) و APITS-2R
(معکوس: 5′-CCC ATT GAT AAA CGG ATT TCC-3′) از نمونه های DNA ژنومی فردی تقویت شد و خصوصاً به ترتیب برای 585 زنجیره های ITS-2 rDNA ی محدوده ای از انواع کریپتوسپوردیا ( اعداد افزایشی AF093012 , AF093008 , AF015774 , AF015773 ) طراحی شده اند [52 و 53] .

با این طراحی ، همان طور که با مقایسه بین آنالیز سیلیکو در مقابل همه ی اطلاعات متوالی در دسترس در پایگاه داده جاری نشان داده شده ، هر یک از پریمرها برای نوع کریپتوسپوردیا معین بود ( به وسیله Gen Bank) . PCR در حجم lµ25 شامل pmol 25 از هر پریمر ، mµ200 از 30mM , dNTP از mgcl2 ، lu پلیمر Gotaq ، (با بارگذاری رنگدار) (peomega) و mµ8 از رنگینه اضافه شده (Invitrogen) SYTO9 ، با شرایط سیکل گرمایی زیر انجام شد : c°94 ، 5 دقیقه (تقلیب اولیه) ، با 40 سیکل c°94 و 30 ثانیه ادامه پیدا می کند (تقلیب) ، c°53/30 ثانیه (بازپخت) و c°68/s30 (انبساط) ، با انبساط نهایی در c°68 برای 10 دقیقه در یک چرخاننده گرمایی ادامه می یابد ( . . . ، Rotor-Gen ، پیکربندی HO65 ، Corbett Rescarch Pty Ltd ) .

و SYTO چون مانع PCR نمی شود و به علت پایداری افزوده اش و عملکرد آن در مقایسه با سایر رنگینه ها ، به عنوان رنگینه استفاده شد [54 و 55] . اندازه گیری های نوری در کانال بسته ( با استفاده از فیلتر دیجیتال ، با تحریک در nm479 و آشکارسازی در nm510 ) در انتهای هر مرحله انبساط ثبت شدند . تقریباً ng5-10 از DNA نوری به هر PCR اضافه شدند ؛ نمونه هایی بدون قالب DNA ای به عنوان کنترل های منفی در هر اجرای PCR وجود داشتند . کم ترین مقدار قالب های ژنومی که 2 ITS – می تواند از آن ها تقویت شود و سپس روی ژل agarose نمایان شود حدود pg 1 تا 2 تخمین زده شود (مثلا ً حدودا ً هم ارز 4 انگل )(نشان داده نشده است) . برای آزمایش کردن ویژگی cPCp 19 نمونه ی DNA ی کنترلی نیاز است که شامل DNA از مدفوع یا خون انسانی که سابقه عفونت انگلی نداشته باشد و DNA از باکتری Lactobacillus acidophilvs , Escherichiacoli و L. gasseri ، مخمر

saaharomyces cerevisiae ، انگل های تک یا خته ای Giardia duodenalis و Entamoeba histolytica ؛ و کرم های انگلی S.mansoni ، Schistosoma japonicum ، Hymenolepis nana ، Taenia saginata ، T. solivan (کرم های پهن ) ، Ascaris sp ، Ancylostoma duodenale ، Necator americanus ، Strogyloides stercoralis ، oesophagostomum bifurcum ، Trichuris trichiura ( Nematoda) می شود که با این روش تقویت در ارتباطند . در ادامه ی PCR ، آنالیز منحنی ذوب امپلیکن ها که به وسیله افزایش دما از 65 به 80 با شیب متغیر افزایشی که از 02 شروع می شود در چرخاننده گرمایی هدایت می شوند (Rotor – Gene 6000) با تغییرات دما تغییرات در فلورانس ضبط شده و رسم می شود . آنالیز HRM با استفاده از نرم افزار 1727 Rotor- Gene با متعادل سازی ناحیه های بین 15/65 – 65/65 و 50/79 – 00/80 و متوسط آستانه اطمینان حدود %90 انجام شد .

 

23 الکتروفورز ژل agarose ، پلی مرفی ترکیب یک طرفه (SSCP) و توالی DNA
شدت و کیفیت امپلیکن ها با استفاده از mM 65 از Tris-HCL T ، mM 27 از اسید برمیک ، mM 1 از اسید تترااستیک دیامین اتیلن (EDTA) ، (TBE) PH9 به عنوان بافر و یک استوانه bp100 به عنوان اندازه ساز ، روی برمید اتیدم %15 (w/v) که باژل های agarose بی رنگ شده ، آزمایش و بررسی شوند .

آنالیز SSCP غیر ایزوتوپی براساس روش B انجام شد (56) . امپلیکن های ITS-2 انتخاب شوند از روی ستون های کوچک پاک شده (wizard PCR prep) و در l 30 از شسته می شوند و سپس به ترتیب دهی خودکار مرتبط می شوند (BigDge chemistry , Applied Biosystems) و در هر دو مسیر ، از همان پریمرهایی که برای PCR استفاده شد (به طور جداگانه) استفاده می شود . علامت های توالی نوکلئوتیدی وقتی با جستجوهای تشابه پایگاه داده غیر زائد GenBank در ارتباط بود بدست آمد .
(NCBI Basic BLASTN ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BIAST )

 

3- نتایج . 310 : ویژگی پریمزها و شرایطPCR و امپلیکن ها
ویژگی مجموعه ایستر AP58SF – APITS – 2R و شرایط PCR برای توسعه محدوده ی ITS-2 با به کارگیری نمونه های مختلف DNA از خون یا مدفوع انسان (بدون اثری از عفونت انگلی) و نمونه های از محدوده ی ارگانیسم های پروکاریوتیک (باکتری) یا ایوکاریوتیک (مخمر ، تک یا فتگان ، trematodes ، cestodes و کرم های انگلی) و مراحل پیشرفته ای که در مجراهای روده ای یا مدفوع انسان اتفاق می افتد ، بنا شده است . کمترین مقدار DNA ژنومی c-parvum که با استفاده از مجموعه پریمز و به وسیله PCR قابل تقویت است ، در 1تا 2 صفحه تخمین زده شده بود که با تحقیق قبلی که با استفاده از منطقه ی کوتاهتری از ITS( به طور مشخص PITS-2 ؛ با میانجی گری ] 33[ . انجام شد سازگار بود . سپس ، ویژگی امپلیکن

هایی که از نمونه های DNA ی ژنومی سوا شده ، استخراج شده اند و نمایانگر انگل های مجزا شده از c.hominis (3n=) و c-parvum (3n=) هستند ، بررسی شد . در ژل های agarose نوار دوتایی (حدود 440 و bp 450) و نوار تکی (حدود bp450) مرتبا ً و به ترتیب c.hominis و c-parvum را نشان دادند . برچسب های زنجیره (> bp 200) با استفاده از

پریمزهای AP58SF یا APITS – 2R از بین همه ی امپلیکن های ITS-2 (مستقیما ً) معین شدند و مقایسه زنجیره اطلاعات با آن ها در پایگاه داده جاری (AJ539190، Aj 539200، AJ539216، AJ539217، AFO93011، AFO93012) هویت مشخص هر امپلیکن را تایید کرد .

32 . تشخیص تغییر پذیری های سنجش داخلی و سنجش میانی
با اثبات ویژگی ها، امپلیکن ها و شرایط PCR ، گام بعدی شناسای شخصیت ذوب امپلیکن های ITS-2 از c.hominis یا c-parvum بود . امپلیکن هایی که نشان دهنده نمونه های DNA ی کنترلی مرجع c.hominis (3 n= ؛ کدهای ch1 ، ch2 ، ch3 ) و c-parvum (3n= ؛ کدهای cp1 ، cp2 ، cp3 ) بودند ، در ابتدا برای برقراری سازگاری (تکرارپذیری) منحنی های ذوب برای نمونه ها در طول یک اجرا و در طول کل اجراها به کار گرفته شدند . (در پنج روز مختلف انجام شد .) ارزیابی دقیق تغییر پذیری های سنجش داخلی و سنجش میانی (کوواریانس) با محاسبه ی میانگین و کوواریانس دمای ذوب در طول 10 تکرار از هر یک از سه نمونه در یک اجرا و در طول پنج اجرا ، انجام شد . برای منحنی 1 (c.hominis) ، ضریب های سنجش

داخلی تغییر (واریانس) برای اولین نقطه ای اوج ذوب 004 (ch1) ، 008 (ch2) ، 005(ch3) و برای دومین نقطه ذوب 006 (ch1) ، 010 (ch2) ، 009 (ch3) بودند . برای منحنی 2 (c-parvum ) ، ضرایب سنجش داخلی تغییر (واریانس) ، 011 (cp1) ، 001 (cp2) 0.02(cp3) بودند . برای منحنی 1 (c.hominis) ، ضرایب های سنجش میانی تغییر (واریانس) ، 014 (ch1) ، 016 (ch2) ، 015 (ch3) برای اولین نقطه ذوب و برای دومین نقطه اوج ذوب ،025 (ch1) ، 016 (ch2) ، 012 (ch3) بودند . برای منحنی 2 (c-parvum) ، ضرایب های سنجش میانی تغییر (واریانس) ، 032 (cp1) ، 022 (cp2) 0.19(cp3) بودند .
شکل 1 منحنی های معرف در آنالیز منحنی ذوب امپلیکن های ITS-2 برای c.hominis (قرمز)،

c-parvum (آبی) یا c.meleagridis (سیاه) (بالایی) ، و منحنی های هنجار شده (نرمال شده) از همان اطلاعات (در پایین) .
جدول 1 . نتایج بدست آمده از DNA ژنومی از کریپتوسپوریدیای مجزا شده از انسان های مبتلا به کریپتوسپوریدیا به وسیله آنالیز منحنی ذوب جفت شده با PCR امپلیکن ITS-2 ، و تعدادی نمونه با منحنی خاص .

بنابراین ، ارزیابی های گسترده تغییرپذیری های سنجش داخلی ومیانی را به ترتیب <%1.5 و %35 نشان داد . 33 دسته بندی نمونه ها بر مبنای آنالیز منحنی ذوب : در ادامه ، همه ی نمونه های آزمایشی DNA ی کریپتوسپوریدیا مربوط به آنالیز منحنی ذوب متصل به PCR بودند ( شکل 1 . cf) . دسته بندی خاص نمونه ها (جدول 1) با نتایجی که قبلا ً به وسیله ترتیب دهی جفت شده با SSCP ی SSU بدست آمده ، مطابقت داشت .] 30،31[ . در این تحقیق ، منحنی های ذوب به وسیله ی نقطه ی اوج های 033± 7247 و 045 ±

7419 (منحنی 1) ، 032 ± 7217 (منحنی 2) و 003 ± 7333 (منحنی 3) مشخص شدند (جدول 1) . امپلیکن هایی که از نمونه های منتخب برای نمایش منحنی 1 (کدهای 10 ch ، 48 ch ، 69 ch ، 93 ch ، 94 ch ) ، منحنی 2 ( کدهای (1cp ، 23cp ، 24cp ، 75cp ، 100cp ) ، و منحنی 3 ( کد 89 cm ) بودند ، به صورت تکه ای زنجیره ای ، و بر مبنای مقایسه با زنجیره های منتخب از پایگاه داده جاری (اعداد در دسترس AFO93012 ، AJ539190، AJ 539200، AJ539217، AJ539216 ، AFO93011، AFO381167) بودند ؛]

33،53،57[ ، به ترتیب برای نمایش c.hominis ، c-parvum و c.meleagridisنشان داده شده اند . وجود دو نقطه ی اوج در منحنی 2 ، به دلیل وجود دو گونه زنجیره اندازه ITS-2 (اختلاف در حدود bp 10) در امپلیکن ها خارج شده از c.hominis بود ؛ وجود دو نوع غالب توالی سازگار با یافته های مطالعه الکتروفورزی قبلی بود . ] 33[

برای هر یک از سه نوع کریپتوسپوریدیا ، منحنی فلورانس نرمال شده از آنالیز HRM (شکل 1 ، پایینی) ، که در آن کاهش تندی در فلوئورنس ثبت شد ، با منحنی ذوب مربوط به آن سازگار بود (شکل 1 ، بالایی) .

4 مباحث و نکات پایانی :
1 اندازه ی امپلیکن های ITS-2 (bp 450 -440) استفاده شده در آنالیزهای کنونی بزرگتر از آن هایی بودند که معمولا ً برای آنالیز منحنی ذوب استفاده می شدند ، بنابراین کاهش احتمالی ظرفیت آشکارسازی جهش وجود داشت ولی با این حال ، هویت مشخص و تفکیک نمونه ها به دست آمد .

برای دریافت اینجا کلیک کنید

سوالات و نظرات شما

برچسب ها

سایت پروژه word, دانلود پروژه word, سایت پروژه, پروژه دات کام,

آخرین مطالب وبلاگ

نظرات مشتریان

سلام و خسنه نباشید اول بگم که سایت خوب و جامع و با امکانات خیلی خوبی دارید.. مهمتر اینکه کاربر رو بعد از خریدش رها نمیکنید و واقعا پاسخگو هستید. موفق باشید ممنون. امیر

Copyright © 2014 cpro.ir